中文摘要

自從1991年首次成功繁殖海鱺 (Rachycentron canadum) 以來，即為台灣箱網養殖漁業的主要方向。本實驗將罹病海鱺體表及體內所分離出病菌經培養特性、形態、生化性狀試驗，初步鑑定與Photobacterium damselae subsp. piscicida相似；分離菌株以16S rRNA定序分析後進行比對，結果與P. damselae subsp. piscicida (GenBank accession No: AY147860.1)相似，其相似度達99%，並對海鱺進行攻毒測試，結果發現半數致死劑量(LD50)為1.0×105.6 cells/ml。為了進一步瞭解P. damselae subsp. piscicida侵入海鱺體內分佈路徑與存活情況，本實驗以菌浴感染海鱺，定期取樣分離細菌及進行螢光原位雜交(fluorescence in situ hybridization)，以觀察侵入海鱺魚體路徑及其感染後在臟器及組織分佈的情形，以1.0×106 cells/ml短期菌浴結果，結果顯示菌浴6小時後可於鰓及腸道分離到P. damselae subsp. piscicida；而無論短期或長期菌浴後4天均可於全身臟器分離出本菌。臨床症狀僅在長期菌浴第2天出現攝餌率下降及體色變黑，剖解下顯示脾、後腎輕微腫大，以及腸道出現白色乳酪狀內容物。組織病理學發現短期菌浴後3小時肝臟出現嚴重空泡化，到第5 天肌肉組織壞死及其大量細菌，第6天脾臟持續性慢性炎症反應；長期菌浴第1天腎小管上皮細胞腫脹，第2天脾臟細胞空泡化並呈現水腫變性，第3天腸道漿膜層增厚及出現大量菌塊，第5天腎臟出現肉芽腫慢性病變。螢光原位雜交結果顯示，本菌感染海鱺由鰓、腸道或肌肉進入魚體後先分佈到腎臟及肝臟，到第4天所有實質臟器均可看到本菌，即發展成全身性感染。並且使用一對特異性引子將人工接種感染的海鱺臟器均質液及菌液，經PCR增幅，得到847 bp產物，可作為臨床上快速診斷巴斯德桿菌的方法。

Abstract

Farming of cobia (Rachycentron canadum) is one of the important maricultured fish species in Taiwan. However, bacterial diseases have plagued cobia aquaculture industry. In this study, based on the growth characteristic, morphological, and biochemical properties of an isolated bacterium, from diseased fish of were similar to those of Photobacterium damselae subsp. piscicida. The 16S rRNA sequence showed 99% identity with P. damselae subsp. Piscicida (GenBank accession number AY147860.1). The pathogenicity experiments were tested by intraperitoneal injection (IP) in juvenile cobia (12~17 g). The LD50 value of P. damselae subsp. piscicida for cobia was 1.0×105.6 cells/ml. In order to understand the spreading routes of P. damselae subsp. piscicida in cobia, we infected in cobia fries with P. damselae subsp. piscicida. The results showed that 6h postinfection, P. damselae subsp. piscicida was isolated from gills and gastrointestines. And at 96h P. damselae subsp. piscicida could be isolated form all organs. Histology and fluorescence in situ hybridization showed that the bacterium enters via gills or gastrointestinal tracts and spreaded to kidney and liver, and eventually developed into systemic infection. In addition, genus-specific sequence of 16S rRNA of pasteurellosis was amplified by PCR using the PDPF and PFPR primer. A 847 bp fragment was observed in all the nodules organ and bacterial suspension. The technique is capable of rapid identification of the sequence pathogen in fish.

目錄

中文摘要 I
英文摘要 II
目錄 III
表次 V
圖次 VI
附錄次 VIII
第一章 緒言 1
第二章 文獻探討 3
第一節 海鱺介紹及分類 3
第二節 巴斯德桿菌歷史背景 5
第三節 巴斯德桿菌的分類及生化特性 6
第四節 巴斯德桿菌致病機制 10
第五節 巴斯德桿菌檢測及診斷 15
第六節 預防與治療 18
第三章 研究目的
21
第四章　材料與方法 22
第一節 實驗設計 22
第二節 海鱺巴斯德桿菌之收集及生理學特牲鑑定
23
第三節 海鱺巴斯德桿菌診斷技術之研發 26
第四節 巴斯德桿菌致病性之研究 35
第五節 巴斯德桿菌菌苗製備 38
第六節 海鱺巴斯德桿菌之組織病理學研究 40
第四章　結果
46
第一節 海鱺巴斯德桿菌之收集及生理學特牲鑑定 46
第二節 海鱺巴斯德桿菌診斷技術之研發 48
第三節 巴斯德桿菌致病性之研究 50
第四節 巴斯德桿菌菌苗製備 53
第五節 海鱺巴斯德桿菌之組織病理學研究 55
第五章　討論 59
參考文獻 119
附錄 132


表次

表1 Photobacterium damselae subsp. piscicida isolated from Rachycentron canadum (cobia) 73
表2 API 20 Strept result of Photobacterium damselae subsp. piscicida isolated from Rachycentron canadum (cobia) 74
表3 Growth of bacterial strains on brain–heart infusion agar (BHIA) and thiosulphate citrate bile salts–sucrose agar (TCBS) plates 75
表4 5株疑似導致海鱺死亡之菌株16S rRNA基因最相似菌 76
表5 Bacterial strains used in this study 77
表6 Challenges of Photobacterium damselae subsp. damselae a on Rachycentron canadum (cobia) by i.p. injection 78


圖次

圖一 海鱺巴斯德桿菌病變外觀 79
圖二 海鱺巴斯德桿菌病變外觀 80
圖三 海鱺病變組織剖檢 81
圖四 海鱺病變組織剖檢 82
圖五 細菌分離菌落 83
圖六 腎臟塗抹片 84
圖七 P. damselae subsp. piscicida生長曲線 85
圖八 16S rRNA電泳圖 86
圖九 由罹病海鱺分離出5株菌株經NCBI以BLSAT project尋找最相似菌株，爾後將其16 rRNA基因序列以Cloustal X進行排序 87-91
圖十 PDP-F/PDP-R專一性測試 92
圖十一 PDP-F/PDP-R靈敏度測試 93
圖十二 攻毒試驗海鱺外觀病變 94
圖十三 由人工接種海鱺分離出菌株經PCR反應結果 95
圖十四 活菌疫苗接種測試之死亡累計圖 96
圖十五 全菌蛋白定量圖 97
圖十六 短期浸泡感染第3小時 (100x, H&E stain) 98
圖十七 短期浸泡感染第5天 (1000x, H&E stain) 99
圖十八 短期浸泡感染第6天 (40x, H&E stain) 100
圖十九 短期浸泡感染第6天 (1000x, H&E stain) 101
圖二十 長期浸泡感染第1天 (400x, H&E stain) 102
圖二十一 長期浸泡感染第1天 (1000x, H&E stain) 103
圖二十二 長期浸泡感染第1天 (1000x, H&E stain) 104
圖二十三 長期浸泡感染第2天 (1000x, H&E stain) 105
圖二十四 長期浸泡感染第3天 (1000x, H&E stain) 106
圖二十五 長期浸泡感染第5天 (200x, H&E stain) 107
圖二十六 PDPF探針標大腸桿菌(E. coli) 108
圖二十七 PDPF探針標定巴斯德桿菌 109
圖二十八 PDPF探針標定自然感染海鱺之腎小管 110
圖二十九 Non-PDPF探針標定自然感染海鱺之腎小管 111
圖三十 PDPF探針標定長期浸泡後6小時 112
圖三十一 PDPF探針標定長期浸泡後12小時 113-114
圖三十二 PDPF探針標定長期浸泡後24小時 115
圖三十三 PDPF探針標定長期浸泡後4天 116-117
圖三十四 PDPF探針標定長期浸泡後6天 118

附錄次

附錄一 pGEM-T vecto 132
附錄二 光學顯微鏡標本之製作、試藥配方及濃度 133-137

參考文獻

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